PAN胎牛血清選擇指南

PAN胎牛血清使用方法

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，經(jīng)常加入5%-20%的胎牛血清，常使用的PAN胎牛血清濃度是10%。高濃度的血清可能改變細(xì)胞的基因表達(dá)譜，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用10%的PAN澳洲胎 牛血清培養(yǎng)293T細(xì)胞，效果非常好。但是有些細(xì)胞也會(huì)使用5%的PAN胎牛血清南美或者20%的PAN胎牛血清，要根據(jù)具體 細(xì)胞選擇合適的PAN胎牛血清濃度。

PAN胎牛血清保存方法

1、需要長(zhǎng)期保存的PAN牛血清必須儲(chǔ)存于-20℃ - 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時(shí)間切勿超過1個(gè)月。切勿將血清在 37℃放置太久,否則血清會(huì)變得渾濁,同時(shí)血 清中的有效成分會(huì)被破壞，而影響血清質(zhì)量。如果一次無法用完一瓶,可 將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中。由于血清結(jié)冰時(shí)體積會(huì)增加約10%,因此,血清在凍入低溫冰箱前，必須預(yù)留 一 定體積空間,否則易發(fā)生污染或玻璃瓶?jī)隽选?/span>

2、一般廠商提供的血清為無菌,無需再過濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物,則可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過濾,切勿直接 過濾血清。

3、瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法:-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天.然后移入室溫,待全 部溶解后再分裝,一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程 中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),使溫度 與成分均一,減少沈淀的發(fā)生。.切勿直接將血清從-20℃進(jìn)入37℃解凍,這樣因溫度改變太大,容易造成蛋白質(zhì)凝集而 出現(xiàn)沉淀。

4、熱滅活是指56℃, 30分鐘加熱已*解凍的血清.加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻.此熱處理的目的是使血清中的補(bǔ)體 成分滅活.除非必須,一般不建議作此熱處理,因?yàn)闊崽幚頃?huì)造成血清沉 淀物顯著增多,而且還會(huì)影響血清的質(zhì)量.補(bǔ)體 參與反應(yīng)有:細(xì)胞毒作用, 平滑肌細(xì)胞收縮, 肥大細(xì)胞和血小板釋放組胺, 增強(qiáng)吞噬作用, 促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞 發(fā)生化學(xué)趨化和活化。

5、血清中的沉淀物 絮狀物:主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成,這些絮狀物不會(huì)影響血清本身 的質(zhì)量.可用離心3000rpm,5分鐘去除,也可不用處理。 顯微鏡下 "小黑點(diǎn)":經(jīng)過熱處理過的血清,沉淀物 的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象"小黑點(diǎn)",常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下,此小黑 點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生 長(zhǎng),但如果懷疑血清質(zhì)量,則應(yīng)立即停止使用,更換另一批號(hào)的血清。

PAN胎牛血清使用中遇到的常見問題總結(jié)

一、血清滅活問題。

1、問：加到培養(yǎng)基中的血清必須滅活嗎？

答：不是必須的，看做什么實(shí)驗(yàn)了。

2、問：PAN胎牛血清滅活是56℃ 30分鐘嗎？

答：如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長(zhǎng)因子。 但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補(bǔ)體受體的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞，血清是 需要滅活，一般是56℃，30min。

3、問：我要做滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，胎牛血清要滅活嗎？

答：進(jìn)口的一般都已滅活，國(guó)產(chǎn)的不一定，還是滅活一下再用較安全。

4、問：我用病毒上清轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎？因?yàn)檠逯锌赡苡行┭a(bǔ)體和抗體，是不是會(huì)影 響轉(zhuǎn)染？我想未滅活的血清中含些抗體補(bǔ)體可能會(huì)和病毒相結(jié)合，影響 轉(zhuǎn)染，正確嗎？細(xì)胞是單核細(xì)胞白血病細(xì)胞， 病毒是病毒包裝細(xì)胞PT67收集的病毒上清。為什么要用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時(shí)，目的是什么？

答：血清一定要滅活，可以先用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時(shí)以后再加血清。避免雜蛋白對(duì)病毒和宿主 結(jié)合過程的干擾，一般是2-6小時(shí)，根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)決定。血清不一定需 要滅活，滅活的目的是將血清中的補(bǔ)體滅活 ！這要根據(jù)實(shí)際情況而定，如果沒有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個(gè)小時(shí)。

5、問：(1)我買的是PAN南美胎牛血清，要滅活嗎？有些說法是需要，有些說直接解凍后就可以加入到培 養(yǎng)基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有關(guān)系嗎？

答：關(guān)于血清的熱滅活，是很多人感興趣也存在一定爭(zhēng)議的話題。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室將血清的熱滅活還是作為 常規(guī)來執(zhí)行，因?yàn)橛袃蓚€(gè)作用，一是滅活補(bǔ)體，第二是滅活血清中可 能存在的支原體。但是實(shí)驗(yàn)者并沒有考慮熱處 理對(duì)血清中的生長(zhǎng)因子、氨基酸等成分帶來的負(fù)面影響。

我在實(shí)驗(yàn)室處理血清的時(shí)候，有一次水浴箱在滅活過程中出現(xiàn)故障，溫度升高到80℃，血清變成了凝膠狀 ，我重新處理了另外一份血清，將兩份血清對(duì)比，發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到 血清所含的抗體蛋白。在56℃下滅活半小時(shí)以 上，肯定也會(huì)對(duì)里面的蛋白起到破壞作用。下次有機(jī)會(huì)我做個(gè)延長(zhǎng)滅活時(shí)間的實(shí)驗(yàn)試試，看看到底有多大的影響。熱 滅活之后，血清放在四 度冰箱久了，就會(huì)有沉淀產(chǎn)生，這常常會(huì)被認(rèn)為是微生物污染或者是黑膠蟲污染。為了驗(yàn)證到 底有沒有污染，常常又會(huì)把血清放置37℃溫育，但是血清中的蛋白會(huì)進(jìn)一步析出，后還是 要做鏡檢，無菌培養(yǎng)試驗(yàn) ，和革蘭氏染色試驗(yàn)，非常麻煩。

我看過一份資料，里面提到70%的實(shí)驗(yàn)者認(rèn)為滅活是理所當(dāng)然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間， 而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等。其中常用的手法是56℃熱處理30 分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高 ，許多早先認(rèn)為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數(shù)對(duì)血清進(jìn)行熱滅活的研究者在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了這一步驟的有效 性和必要性。有人比較 過11個(gè)不同細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對(duì)6 個(gè)細(xì)胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纖維細(xì)胞，MRC-5) 的生長(zhǎng)帶來負(fù)面影響，三個(gè)細(xì)胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響，而只有兩個(gè) 細(xì)胞株(Balb/3T3， Sp2/0Ag14 hybrid)，在熱滅活之后，細(xì)胞生長(zhǎng)有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒 有明顯的促進(jìn)作用。

你可以摸索一下，血清從-20℃冰箱拿出來之后在常溫解凍，然后混勻分裝成兩份，一份滅活，一份不滅活 ，比較這兩種血清對(duì)細(xì)胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活。 這個(gè)過程多也就一個(gè)星期。同時(shí)你還要考慮 血清滅活與否對(duì)你后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有沒有影響。

問：(2)分裝后的血清從-20℃取出放4℃讓其液化，卻見血清比較混濁，有沉淀產(chǎn)生，這屬正常嗎？

答：正常。

二、血清的保存問題。

1、問：2016年6月到期的PAN血清到2017年5月還能用嗎？

答：只有試試了，如果一直在-20℃凍著來者，應(yīng)該還可以，先少用點(diǎn)看看。養(yǎng)細(xì)胞系應(yīng)該沒問題，原代不 行。

2、問：請(qǐng)問我自然溶化好的胎牛血清和1640培養(yǎng)基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室溫下 一晚行嗎？100毫升培養(yǎng)瓶加多少培養(yǎng)基呢？

答：可以放4℃。4-5ml。

3、問：4℃冰箱內(nèi)保存3個(gè)月的胎牛血清，能否繼續(xù)使用？相關(guān)細(xì)胞和其它試劑的代價(jià)比較高，不敢輕易嘗 試。

答：需要長(zhǎng)期保存的PAN胎牛血清必須要保存在-20至-70℃的低溫冰箱中，4℃冰箱中保存時(shí)間不要超過1 個(gè)月。

三、血清滅活時(shí)溫度問題。

1、問：因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室水浴鍋失控，血清滅活時(shí)，溫度到了61.7℃，這血清還能用嗎？

答：多長(zhǎng)時(shí)間?。慷虝r(shí)間應(yīng)該可以吧，我有一次加熱了一個(gè)多小時(shí)，還照樣用。

2、問：我滅活胎牛血清時(shí)，用的電磁爐，定在了70℃，本來說調(diào)溫度到56℃再放血清的，后來忘了，就把 血清放進(jìn)去了，所以滅活的溫度肯定超過56℃了，不知道這樣對(duì)血清 有沒有影響？

答：常規(guī)滅活建議的溫度在45℃到62℃之間，而時(shí)間則從15分鐘到60分鐘不等，其中常用的手法是56℃ 熱處理30分鐘。看看你養(yǎng)的細(xì)胞是什么，一般的話估計(jì)問題不大，要是 很珍貴的細(xì)胞還是慎重一點(diǎn)啊。熱滅活目的是 為了去除血清中補(bǔ)體等對(duì)熱敏感的物質(zhì)， 在對(duì)補(bǔ)體滅活以外，熱處理同時(shí)也對(duì)血清中可能存在的支原體具有滅活作 用?，F(xiàn)在好像不主張熱 滅活，熱滅活經(jīng)常給血清產(chǎn)品帶來負(fù)面影響，對(duì)血清的加熱經(jīng)常導(dǎo)致血清中沉淀的產(chǎn)生，此外 ，有研究結(jié)果證實(shí)熱滅活步驟減弱了胎牛血清和小牛血清對(duì)細(xì)胞的促粘附作用。

四、FBS可否代替人AB型血清？

問：我現(xiàn)在在做人的外周血b淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)，文獻(xiàn)上要求用人的AB型血清，但是我覺得很多代理商都沒有 。我想FBS代替，但不知道可否，我先是擔(dān)心免疫排斥之類，但是我查 了些資料后，應(yīng)該不會(huì)(我覺得)。但是我又不 能夠TRY。因?yàn)榧?xì)胞因子確實(shí)太貴了，所以咨詢一下。謝謝！

答：你照文獻(xiàn)的做。除非你系列實(shí)驗(yàn)證明你用代用品的結(jié)果與文獻(xiàn)的相同(你還是要用到文獻(xiàn)的試劑) 。細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素很多，特別是培養(yǎng)基的成分。

五、血清的制備方法問題。

1、問：我的實(shí)驗(yàn)需要自己制備一些血清用于培養(yǎng)細(xì)胞，有沒有人知道用于培養(yǎng)細(xì)胞的血清需要怎樣的制備 過程？

答：自己制備血清當(dāng)心污染啊。如果無菌條件好的話，用靜置析出方法就行。

2、問：一般我們用得胎牛血清用前還要滅活，我想用大鼠的血，不知道要不要滅活？

答：你直接把采來的血液在離心管里4℃過夜，離心，取上清，在無菌過濾，也可滅活，然后分裝凍存，用 時(shí)再配。

3、問：如果滅活會(huì)不會(huì)對(duì)血清中的一些因子有損傷？

答：加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺， 激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在進(jìn)行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞 和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。滅活 一般不會(huì)對(duì)血清中的一些因子損傷的。

六、心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)血清的使用問題。

1、問：在進(jìn)行心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)，需要用含血清的培養(yǎng)基中止胰酶的消化作用，我現(xiàn)在使用的是含PAN澳洲血清 10%的培養(yǎng)液，但近日看北醫(yī)一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的課件發(fā)現(xiàn)，有用1%血清培 養(yǎng)液進(jìn)行中止消化的，想問一下，1%的是否可 以，效果是否有保證？這樣確實(shí)能節(jié)省不少血清的。

答：關(guān)于心肌細(xì)胞元代培養(yǎng)的FBS問題：

(1)1%的血清*培養(yǎng)基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌細(xì)胞元代培養(yǎng)就不行。 10%的FBS* 培養(yǎng)基效果都不太好，開始心肌細(xì)胞元代培養(yǎng)需要高濃度的FBS，20%左 右，但這就有出現(xiàn)另一個(gè)問題，在FBS*培 養(yǎng)基中，成纖維細(xì)胞呈優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，須得在培養(yǎng)基加入適量的BrdU以抑制其生長(zhǎng)，純化心肌細(xì)胞。

(2)FBS的作用不僅僅是拿來中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白質(zhì)如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用 。

(3)元代心肌細(xì)胞培養(yǎng)的FBS使用，有講究：剛開始使用20%左右的高濃度的FBS，后逐漸遞減為無血清的 DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2、問：我胰酶的用量是0.08% ，并混和了0.08%的膠原酶。FBS要高濃度遞減是否是說的在細(xì)胞培養(yǎng)中啊， 難道在消化時(shí)終止也需要如此高的濃度嗎，還有，我的BRDU只用到48 小時(shí)就不用了，因?yàn)閾?dān)心其損傷太大，可以持續(xù) 用多久呢？

答：我用10%FBS終止的，然后差速1h，然后還是用10%FBS的HG-dmem養(yǎng)的，沒有用brdu，心肌細(xì)胞還是比 較多和穩(wěn)定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就會(huì)有搏動(dòng)。

七、血清和培養(yǎng)基的種類及品牌問題。

1、問：細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清用哪個(gè)公司的產(chǎn)品比較好呢？周圍有人用PAA或Hyclone的，這兩種跟Gibco或 PAN胎牛血清出品的差別大嗎？

答：如果是長(zhǎng)得非?？斓眉?xì)胞如pa317，293，c6等惡性腫瘤細(xì)胞，一般得國(guó)產(chǎn)血清就可以，如果是原代培 養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)用胎牛血清或類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，Hyclone公司血清的 質(zhì)量不如GIBCO(同類血清)。國(guó)產(chǎn)的杭州四季青和甘肅民海（中美和資）不錯(cuò)。有些細(xì)胞(如：sf9，293還有其他一些元代細(xì)胞)，用Gibco的比其他兩種好很多， 會(huì)大大加速試驗(yàn)進(jìn)度。 對(duì)于其他一些細(xì)胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的 還要看產(chǎn)地。

2、問：近要訂一瓶胎牛血清，實(shí)驗(yàn)室之前都在用小牛血清，沒有買過胎牛血清。請(qǐng)問哪個(gè)公司的好一些 ？問過試劑公司，有兩種：一種是PAA的(分普通級(jí)和優(yōu)級(jí))，一種是 Hyclone的(只有普通級(jí)，而且是新西蘭產(chǎn)的)。 試劑公司推薦使用PAA優(yōu)級(jí)的，但看好多文獻(xiàn)都用Hyclone的，公司說是因?yàn)楝F(xiàn)在Hyclone的都不是美國(guó)進(jìn)口的了。請(qǐng) 問用的哪種胎牛血清 比較好？

答：民海的效果還不錯(cuò)，要是不放心國(guó)產(chǎn)的，那就買進(jìn)口的。進(jìn)口的好多公司都有，新西蘭產(chǎn)的效果一般 。PAN胎牛血清還可以。民海的似乎比四季青的要好 些。復(fù)蒙的感覺也不錯(cuò)。

3、問：四季青“無噬菌體、低內(nèi)毒素胎牛血清"與“無支原體胎牛血清"的區(qū)別 ？培養(yǎng)腫瘤傳代細(xì)胞用哪一個(gè)比較好些？

答：用無支原體胎牛血清就可以啦。

4、問：SKBR-3細(xì)胞培養(yǎng)用哪種型號(hào)的1640培養(yǎng)基及胎牛血清？

答：我一直用GIBCO的1640，你可以買含HEPES的1*10L的包裝，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。

八、牛血清污染噬菌體的問題。

1、問：有誰知道小牛血清制造過程中怎樣能夠避免噬菌體的污染，以及對(duì)已污染噬菌體的牛血清怎樣能夠 除去噬菌體？

2、問：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌體，它對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)到底有什么影響？

暫無回答。

九、培養(yǎng)基血清濃度問題。

問：在1640里加PAN澳洲胎牛血清時(shí)加多了，90ml里加了20ml血清，約為18%，以前都是加10ml的，查了網(wǎng)上多建議用 10%-15%，有關(guān)系嗎？

答：我認(rèn)為一般來說血清濃度的較大波動(dòng)對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)影響較大，建議再加90ml1640調(diào)成10%。血清濃度大 當(dāng)然細(xì)胞狀態(tài)感覺要好，但是高濃度的血清可能改變細(xì)胞的基因表達(dá) 譜，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。10%的濃度培養(yǎng)鼻煙 癌細(xì)胞很好。

十、問：MTT加藥的時(shí)候加不加血清？加藥時(shí)要用無血清的培養(yǎng)基嗎？

答：我的藥就是用含PAN胚胎干細(xì)胞胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋的，不含血清的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞有毒性或抑制作用，無形中對(duì)細(xì)胞造 了一個(gè)serum-free的模型，細(xì)胞在提內(nèi)本來就是有血清供應(yīng)，如果該藥 物都不能對(duì)抗，那該藥物就沒有什么臨床價(jià) 值了，這是我的理解。

十一、PC12細(xì)胞培養(yǎng)所用血清問題。

問：我正準(zhǔn)備購(gòu)買上海細(xì)胞所的未分化的PC12細(xì)胞，需要滅活的馬血清，可現(xiàn)在買血清很困難，好像是海 關(guān)有封.鎖，代理商這么說的，我原定購(gòu)買的Gibco的horse surum，現(xiàn)在 無法買到了，好容易找到一個(gè)目前可以進(jìn)血 清的公司Hyclone，有一種Donor Equine serum是馬血清嗎？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是這個(gè)。我當(dāng)時(shí)是在鼎國(guó)(重慶辦事處)買的， 100ml大概140元，具體不記得了。當(dāng)時(shí)是看它比別的進(jìn)口的馬血清便宜 。另外：我買了以后滅活的。

十二、AB血清的制備問題。

問：本人想從人的外周血中分離AB血清的，用于B淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)。謝謝大家給點(diǎn)建議。人的血，來之不易 啊。

答：是AB血型人的血清嗎？這種血清即沒有抗A型抗原抗體，也沒有抗B型抗原抗體。分離血清時(shí)將采集的 血液注入試管中，待血液凝固后離心分離血清?？蓪⒉杉难悍旁?7 ℃水浴箱中促進(jìn)血液凝固，減少凝固時(shí)間。離 心可在2500～3000rpm，10min，足可以分離血清。分離后將血清吸出保存即可。分離血清的量可按采集血液的50%左 右計(jì)算，因?yàn)榧t細(xì)胞占 總血液的50%左右。當(dāng)然整個(gè)過程要注意無菌操作。

十三、PAN胎牛血清南美內(nèi)是否含糖？

問：我想做糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的試驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖對(duì)我 實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)液糖終濃度影響比較大。今天打電話問GIBCO公司的技術(shù)顧 問，回答我糖濃度少于5μg/ml，因此基本 可認(rèn)為是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我們醫(yī)院檢液科，結(jié)果卻是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。難道是檢 測(cè)人血清的血糖濃度的方 法不能用于檢查牛血清嗎？(另起茶水驗(yàn)?zāi)蚴录?檢驗(yàn)科沒有給我回答。

答：應(yīng)該是不含糖的。

十四、PAN胎牛血清北美或培養(yǎng)基產(chǎn)生了顏色或沉淀的問題：

1、問：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30分鐘滅活后出現(xiàn)了白色少量絮狀沉淀，是不是污染？還能不能 再用？血清的生產(chǎn)日期是2006年7月(現(xiàn)在是2007年6月11日)。

答：應(yīng)該問題不大。你可以取少量血清放入培養(yǎng)皿中，37℃過夜培養(yǎng)看看就知道是否污染了。血清中沉淀 物的出現(xiàn)有許多種原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所 造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在 血渭解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。 若您欲去除這些絮狀沉 淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起 過濾。

2、問：我用MTT法測(cè)細(xì)胞的增殖，用DMSO裂解細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)把DMSO加入到孔中就會(huì)形成乳白色(用的含胎牛血 清的1640培養(yǎng)基，由于沒有離板子的離心機(jī)，所以沒有去除培養(yǎng)基直 接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培養(yǎng)基沒有 看到有這種情況。該怎么解決？

答：為什么要用離心機(jī)離心呢？難倒你養(yǎng)的是懸浮細(xì)胞嗎？如果是貼壁細(xì)胞的話直接將MTT倒掉，再加DMSO 即可，我們就是這么做的，效果很好！并且測(cè)細(xì)胞的增殖的話如果不 去掉MTT就加DMSO的話誤差應(yīng)該很大！有時(shí)不一 定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的時(shí)間或以及其他成分有關(guān)！

3、問：(1)PAN胎牛血清500ml，今天解凍后沒有混勻直接分裝，結(jié)果使得前面的幾管是清亮的，后面就 帶有棕色的，不知有沒有影響？估計(jì)有什么影響？前面 的成分好還是棕色的成分好??？

答：肯定有。還是重新混合重新分裝，我覺得有效成分會(huì)集中在棕顏色部分。

問：(2)為什么會(huì)出現(xiàn)棕色呢？

答：PAN胎牛血清中的棕色多一些可能是因?yàn)榧t蛋白的含量高些的緣故吧。

問：(3)PAN ES血清滅活之后可以存放嗎？我的是前天.滅活的，但是沒有加到培養(yǎng)基里，而是放在冰箱里，那下次 可以直接用嗎？還是再次滅活啊？

答：當(dāng)然可以，如果多的話，分裝后放在－20℃，下次用時(shí)再解凍，也不用再滅活。用一管拿一 管，少許血清可以放在4℃。分裝時(shí)還要注意不要裝得太滿，以免溢出污 染。

十五、污染和過濾的問題。

1、問：懷疑血清染菌，想用濾膜過濾一下，可否自己用0.22μm濾膜過濾？對(duì)血清性質(zhì)有多大影響？有 做過的么？

答：可以過濾的，PAN南美血清，PAN北美血清，PAN澳洲血清，PAN ES血清當(dāng)出廠時(shí)都是0.22μm或0.1μm過濾除菌。想證明有沒有染菌不用過濾這么麻煩 ，只要放置于37℃過夜就可以了，如果有微生物污染會(huì)變渾濁的，如 果還是澄清的就說明沒有問題的。實(shí)驗(yàn)室中血清 很難直接過濾，一般要加到培養(yǎng)基中再過濾。我們實(shí)驗(yàn)室制備培養(yǎng)基時(shí)，都使用濾膜過濾，一般而言如果制備1-2瓶 培養(yǎng)基，一個(gè)濾膜及 一支30ml注射器可以過濾50ml小牛血清。如果大量制備培養(yǎng)基也可以將血清加到培養(yǎng)基中，使 用0.22微米的大濾膜一起過濾。

2、問：我懷疑我用的*1640培養(yǎng)液被污染了，準(zhǔn)備重新過濾消毒，過濾后是否需要補(bǔ)充胎牛血清？如需 又如何補(bǔ)充？

答：*1640培養(yǎng)液被污染了，如果是支原體的話，過濾沒有作用，支原體可以通過濾膜。我們用1640液 ，都是配液后保留500ml，然后其他的分裝100-200ml，現(xiàn)用現(xiàn)配因?yàn)檠?清比1640要貴，如果你想過濾的話，建議你 加原比例血清，因?yàn)檠宀粫?huì)很容易通過濾膜。主要的還是找到可能污染的原因。

3、問：加好了血清雙抗的培養(yǎng)基由于污染了再過濾后還能用嗎？

答：建議不要用了。在加了雙抗的情況下已經(jīng)污染，那么細(xì)菌污染的可能性會(huì)較小了。一般的過濾除不能 去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、問：我準(zhǔn)備把使用的*1640培養(yǎng)液重新過濾一遍，不知道培養(yǎng)液中的血清成分是否能通過濾膜，過濾 后是否還需要補(bǔ)充胎牛血清？如需又如何補(bǔ)充？

答：可以透過，但是隨著液體量的增多會(huì)很慢，如果不加壓會(huì)比較麻煩，還有用低蛋白吸附的，不然 損失是比較大的。

十六、問：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)能否加血清？如果加了會(huì)有什么結(jié)果？為什么懸浮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)就不能加血清？

答：血清是細(xì)胞培養(yǎng)基中重要的培養(yǎng)成份之一，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有廣泛影響。在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，我們通常會(huì)加入 10%的血清。血清的質(zhì)量對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的成功至關(guān)重要。一般說來，牛血清 包括以下成分：生長(zhǎng)因子(如激素，白細(xì)胞介 素等)，他們可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；貼附因子，他們可以促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，往往只有細(xì)胞貼壁才能增值(懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞 除外)；蛋白質(zhì)(如血清 白蛋白，球蛋白等)，既可以作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又可以中止胰酶的作用；還有很多成分不明的物 質(zhì)。血清還可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金屬和某些蛋白酶的毒性。血清還可以是細(xì)胞免 受機(jī)械損傷。因此，無 論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，血清是*的。除非因?qū)嶒?yàn)要求無血清培養(yǎng)時(shí)，例如：為使細(xì)胞同步化時(shí)，我們會(huì) 采用無血清培養(yǎng)的。單純的說懸浮細(xì)胞培養(yǎng)不 能加血清就沒有太多的道理了。

十七、關(guān)于中和消化液需要的血清量。

問：用胰蛋白酶消化細(xì)胞后，需要用血清中和。具體這種中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之間的比例是 多少？

答：做了很久的試驗(yàn)，真的沒有想過胰酶和血清的對(duì)應(yīng)關(guān)系。不過細(xì)想下來，這個(gè)應(yīng)該也沒有固定的比值 。血清的品種都是不同的，成分必然有差異，如何能確定其與胰酶的比 值關(guān)系？我們消化細(xì)胞的時(shí)候，如果是傳代， 細(xì)胞變形后，吸出胰酶直接加入適量的hanks液或者全培，這個(gè)量看自己的喜好和吹打細(xì)胞方便而定。一般都可以中 止消化的。不會(huì)存在繼 續(xù)消化的事情。如果是從組織上消化細(xì)胞做原代培養(yǎng)，我一般都使用全培進(jìn)行中止，而且加的 很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例應(yīng)該是足夠的。當(dāng)然全培是2，一般我養(yǎng)細(xì)胞 的時(shí)候，會(huì)用國(guó)產(chǎn)的比 較便宜的血清配制全培，專門用于中止消化，這樣有幾個(gè)好處：一是中止消化的效果應(yīng)該好于hanks液吧，再是也有 利于維持細(xì)胞活性。而且這部分液體會(huì)被離心 去掉，血清便宜，離心掉了不會(huì)心疼。而養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候用好血清。個(gè)人 觀點(diǎn)，僅供參考。

十八、血清中的懸浮物問題。

1、問：發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞瓶中背景有許多的小黑點(diǎn)，培養(yǎng)液中也有一些漂浮的物?？戳酥暗奶詾槭悄z原 蟲。本打算換液，換液前特意看了下前些天配的培養(yǎng)液，肉眼發(fā)現(xiàn)培養(yǎng) 液中有懸浮的顆粒狀物質(zhì)(不多)，于是放在鏡 下觀察，新鮮培養(yǎng)液中有一些懸浮的小顆粒，不多。(培養(yǎng)液是R1640+20%牛血清+1%雙抗)于是又將分裝在4℃保存的 小牛血清拿出觀察，肉 眼可見5、6個(gè)白色小小球狀的物質(zhì)，在血清瓶稍靠下的部位懸浮。鏡下觀察，也有少量的不知 什么物質(zhì)的東西漂浮。小牛血清是Hyclone新西蘭的，標(biāo)簽上寫已經(jīng)經(jīng)過2μm濾膜過濾處 理。根據(jù)上述培養(yǎng)液的情 況，是否說明培養(yǎng)液已被污染？如果是正常的血清是不是在鏡下不應(yīng)該看到雜物，哪怕是極少量的？根據(jù)上述血清的 描述，是不是說明血清也存在問題，還能用 嗎？補(bǔ)充：細(xì)胞培養(yǎng)以來生長(zhǎng)狀態(tài)就不好。買血清的時(shí)候廠家說明不用滅 活，所以未滅活。

答：(1)血清應(yīng)該-20℃保存，解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變 的溫度太大實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)PAN胎牛血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白 在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦可造 成沉淀物。

(3)若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清，再放回冷凍，若存放于4℃時(shí)，請(qǐng)勿超過一個(gè)月，儲(chǔ)存 在2－8℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可見 的混濁。

(4)解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(5)排出了血清的原因，在考慮實(shí)驗(yàn)用品和無菌操作的問題。

(6)細(xì)菌病毒、衣原體、黑膠蟲污染也很常見，如果細(xì)胞死的太多，影響較大建議更換培養(yǎng)液。

2、問：今天在配培養(yǎng)液時(shí)，發(fā)現(xiàn)血清里面有小碎片樣的漂浮物，血清仍然清亮，不渾濁。不知道是什么， 問了實(shí)驗(yàn)室的學(xué)長(zhǎng)，說仍然可以用，但還是不放心，沒有用血清。求助 園子的各位達(dá)人，這可能是血清出了什么問題 ？我的血清用了一個(gè)月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培養(yǎng)液配置時(shí)Votex不夠，當(dāng)時(shí)是清亮的，但過一段時(shí)間會(huì)析出來；(2)真菌污染。

十九、更換無血清培養(yǎng)基后細(xì)胞大量死亡的問題。

問：我使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前要換上無血清的培養(yǎng)基。本來?xiàng)l件模的好好的，轉(zhuǎn) 染效率也可以接受。但是寒假一回來就發(fā)生了怪事：細(xì)胞在有血清的 培養(yǎng)基中長(zhǎng)的好好的，一換無血清的培養(yǎng)基就死 亡。大概4個(gè)小時(shí)就能看到較多的細(xì)胞飄起來。但是原來我換無血清培養(yǎng)基，就算放那里10個(gè)小時(shí)都是沒問題的啊。 已經(jīng)換了不同批次的 培養(yǎng)基，甚至吸管什么的都換過了，但是就是不行，是怎么回事？

答：(1)兩周后的培養(yǎng)液應(yīng)補(bǔ)加谷氨酰胺，或者重新配液，轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)不含抗生素。

(2)確認(rèn)操作方法和環(huán)境，建議檢查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂質(zhì)體的毒性很大，如果有質(zhì)粒參與對(duì)細(xì)胞損傷更大，如果Lipofectamine2000 在常溫放置過，對(duì)細(xì)胞更大，假期冰箱是否斷過電。

(4)培養(yǎng)箱的溫度、c02濃度，濕度。

二十、*培養(yǎng)液的相關(guān)定義。

問：“*培養(yǎng)液一詞"，是指加了血清的培養(yǎng)液?jiǎn)?？我在做含藥血清的?shí)驗(yàn)，涉及到PAN胎牛血清添加量的問題。所以想弄明白文中所指的 “*培養(yǎng)液"是否是含藥血清。

答：原液是指配置后過濾除菌。不*培養(yǎng)液是指不含有血清的原液，其他成分已補(bǔ)充。*培養(yǎng)液是指 不*培養(yǎng)液加入血清后稱*培養(yǎng)液。

二十一、血清相關(guān)知識(shí)總結(jié)。

使用胎牛血清的注意事項(xiàng)：

血清是細(xì)胞培養(yǎng)中重要的元素之一。下面是實(shí)驗(yàn)室里常會(huì)遇到的問題，僅供大家參考：

1、保存血清的方法：

建議血清應(yīng)保存在-5℃ 至 -2O ℃ 。然而，若存放于 4 ℃ 時(shí)，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。若您一次無法用完一瓶 ，建議您無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

2、如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損：

建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室溫下使之全溶。但必須注意的是， 溶解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。

3、PAN牛血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理：

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但普的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成 凝血的蛋白之一)在血渭解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物 的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影 響血清本身的質(zhì)量。

若您欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心，上清液即可接著加入培 養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因 為它可能會(huì)阻塞您的過濾膜。

4、何謂熱滅活：

一般是以 56℃ ， 30 分鐘來處理已解凍的血清，因?yàn)榇思訜岵襟E，可以使補(bǔ)體去活化，而補(bǔ)體所參與的 反應(yīng)有 : 溶細(xì)胞活性，平滑肌的收縮，肥大細(xì)胞和血小板組胺的釋放 ，增強(qiáng)吞噬作用，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的趨化 和激活。

5、關(guān)于胎牛血清的滅活：

有必要做熱滅活嗎？

實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生 長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或*沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊?了血清的質(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。 而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)" ，常常會(huì)讓研究者誤以 為是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是 微生物的分裂擴(kuò)增。

因此我們建議您，若非必須，您可以不需要做熱處理這一步。如此一來，不但節(jié)省您寶貴的時(shí)間，更確保 您血清的質(zhì)量！

6、PAN胎牛血清相關(guān)知識(shí)：

如何避免沉淀物的產(chǎn)生？

我們建議您在使用血清的時(shí)候，注意下列的操作 :

(1)解凍血清時(shí)，請(qǐng)按照所建議的逐步解凍法(-2O℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃ 至37℃)，實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)解凍血清時(shí)，請(qǐng)隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)請(qǐng)勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì) 因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守56℃，30 分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高，時(shí)間過久或搖 晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。

PAN南美胎牛血清

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