使用前仔細(xì)閱讀本說明書。本酶聯(lián)免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術(shù)原理，來檢測大鼠核因子κB受體活化因子配基（RANKL），只能用于研究用途，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。 用 途：用于大鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中核因子κB受體活化因子配基（RANKL）測定。 工作原理： 本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中大鼠核因子κB受體活化因子配基（RANKL）水平。向預(yù)先包被了大鼠核因子κB受體活化因子配基（RANKL）單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入大鼠核因子κB受體活化因子配基（RANKL），溫育；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗核因子κB受體活化因子配基（RANKL）抗體。再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠核因子κB受體活化因子配基（RANKL）的濃度呈正相關(guān)。 試劑盒組成 ： 試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 | 說明書 | 1份 | 1份 | | 封板膜 | 2片（48） | 2片（96） | | 密封袋 | 1個 | 1個 | | 酶標(biāo)包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 | 標(biāo)準(zhǔn)品960 pmol/L | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 | 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 | 鏈霉親和素-HRP | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 | 生物素標(biāo)記的抗RANKL抗體 | 0.5ml×1瓶 | 1 ml×1瓶 | 2-8℃保存 | 顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 | 顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 | 終止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 | 濃縮洗滌液 | （20ml×20倍）×1瓶 | （20ml×30倍）×1瓶 | 2-8℃保存 |
需要而未提供的試劑和器材: - 37℃恒溫箱
- 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
- 精密移液器及一次性吸頭
- 蒸餾水
- 一次性試管
- 吸水紙
注意事項: - 從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
- 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差
- 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
- 為避免交叉污染，要避免重復(fù)使用手中的吸頭和封板膜。
- 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
- 底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。
洗板方法: 1.手工洗板方法：甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。 2.自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中 標(biāo)本要求： 1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。 2．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 操作程序： - 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。)
480 pmol/L | 5號標(biāo)準(zhǔn)品 | 120μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 240 pmol/L | 4號標(biāo)準(zhǔn)品 | 120μl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 120 pmol/L | 3號標(biāo)準(zhǔn)品 | 120μl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 60 pmol/L | 2號標(biāo)準(zhǔn)品 | 120μl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 | 30 pmol/L | 1號標(biāo)準(zhǔn)品 | 120μl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入120μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
- 根據(jù)代測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
- 加樣：1）空白孔，空白對照孔不加樣品，生物素標(biāo)記的抗RANKL抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；2）標(biāo)準(zhǔn)品孔：加入標(biāo)準(zhǔn)品50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標(biāo)準(zhǔn)品中已事先整合好生物素抗體，故不加)；3）代測樣品孔：加入樣本40ul，然后各加入抗RANKL抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60分鐘。
- 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
- 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
- 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
- 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
- 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
- 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度。也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。
操作程序總結(jié)： 
試劑盒性能： 1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上。 2.批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于9%和15% 檢測范圍： 檢測范圍：20 pmol/L -500 pmol/L 保存條件及有效期： 保存：2-8℃。 有效期：6個月(2-8℃)。 |
