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蛋白質(zhì)的定量測定實驗
  • 發(fā)布日期:2011-12-23      瀏覽次數(shù):2259
    •                                                      蛋白質(zhì)的定量測定實驗

      蛋白質(zhì)定量是生物化學、食品檢驗和其它生命學科zui常涉及的分析內(nèi)容,是臨床診斷的重要指標,也是許多生物制品、藥物、食品質(zhì)量檢測的重要指標。生化實驗中,在對生化藥品,特別是蛋白質(zhì)、酶、某些多肽或蛋白質(zhì)激素的分離純化時,對蛋白質(zhì)進行準確可靠的定量分析是非常重要的。
          然而蛋白質(zhì)的種類很多,結(jié)構(gòu)不均一,分子量又相差很大,功能各異,這給建立一個理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來了很大的困難。目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種,不同的方法各有其特點。
          紫外分光光度法是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)來對蛋白質(zhì)進行定量的;而凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法、BCA法、膠體金法測試根據(jù)蛋白質(zhì)的化學性質(zhì)來實現(xiàn)對蛋白質(zhì)進行定量的;根據(jù)蛋白質(zhì)的染色性質(zhì)的不同,又建立了考馬氏亮藍染色法和銀染法;此外還有人在這些蛋白質(zhì)定量方法的基礎上建立了熒光法。
          由于每種方法都有其自身的特點和局限性,因而需要在了解各種方法的基礎上根據(jù)不同情況選用恰當?shù)牡鞍踪|(zhì)測定方法,以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果zui,但操作復雜,用于大批量樣品的測試則不太合格;雙縮脲法操作簡單,線性關系好,但靈敏度差,樣品需要量大,測量范圍窄,因此在科研上的應用受到限制;而酚試劑法彌補了它的缺點,它結(jié)合了雙縮脲法中銅鹽反應與Folin-ciocalteau試劑反應的特點,因而在科研中被廣泛采用,但是它的干擾因素較多;考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而簡便開始重新受到關注;BCA法以其試劑穩(wěn)定,抗干擾能力較強,結(jié)果穩(wěn)定,靈敏度高而受到歡迎;而膠體金法具有較高的靈敏度,可達到毫微克水平,用于微量蛋白的測定。


                               附:常用的測定蛋白質(zhì)含量方法的比較

      方   法
      測定范圍
      (μg/ml)
      不同種類
      蛋白的差異
      zui大吸收
      波長(nm)
      特                 點
      凱氏定氮法
       
       
      標準方法,準確,操作麻煩,費時,靈敏度低,適用于標準的測定
      紫外分光光度法
      100—1000
      280
      205
      靈敏,快速,不消耗樣品,核酸類物質(zhì)有影響
       
       
      雙縮脲法
      1000—10000
      540
      重復性、線性關系好,靈敏度低,測定范圍窄,樣品需要量大
      Folin-酚試劑法
      20—500
      750
      靈敏,費時較長,干擾物質(zhì)多
      考馬氏亮藍G-250
      50—500
      595
      靈敏度高,穩(wěn)定,誤差較大,顏色會轉(zhuǎn)移
      BCA
      50—500
      562
      靈敏度高,穩(wěn)定,干擾因素少,費時較長

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