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概述：

• 如何借助 DuraClone 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)人外周血單核細(xì)胞 (PBMC) 進(jìn)行染色，以進(jìn)行 T 細(xì)胞受體分析。

• 如何運(yùn)用 CytoFLEX 流式細(xì)胞儀和 DuraClone 對(duì) TCR 亞群進(jìn)行鑒定。

介紹：

T 細(xì)胞在免疫系統(tǒng)的功能與調(diào)控中扮演著重要角色。成熟的 T 細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá) CD3 和 T 細(xì)胞受體 (TCR)?；?TCR: 有 αβ T（T 細(xì)胞庫(kù)的 95%）和 γδ T（T 細(xì)胞庫(kù)的 5%）兩種類(lèi)型，它們能夠進(jìn)一步分裂成兩個(gè)亞群。又因 TCR αβ T 細(xì)胞分別與 MHCII 類(lèi)或 MHC I 類(lèi)抗原相結(jié)合的親和力，其可以隨即區(qū)分為 CD4 T 細(xì)胞或 CD8 T 細(xì)胞。γδ T 細(xì)胞的zui大子集可以表達(dá) Vδ2 TCR 復(fù)合物。γδ T 細(xì)胞的較小子集可以表達(dá) Vδ1 TCR 復(fù)合物。研究 TCR γδ Vδ2 T 細(xì)胞和 TCR γδ Vδ1 T 細(xì)胞，對(duì)于母胎¹ 和同種移植耐受² 是非常重要的，而了解眾多 T 細(xì)胞亞群，對(duì)于各種常規(guī)和病理學(xué)研究也是相當(dāng)重要的。DuraClone IM Panel，這是一種在室溫下?tīng)顟B(tài)穩(wěn)定的干粉試劑混合物。根據(jù) ONE Study 以及專(zhuān)業(yè)的流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供的設(shè)計(jì)建議，進(jìn)行試管配制，用于臨床研究領(lǐng)域。本文將介紹在 CytoFLEX 上運(yùn)行裝有正常 PBMC 的 DuraClone IM TCR 試管的情況。

方法：

• 人外周血單核細(xì)胞 (PBMC) 分離

用 1X PBS + 3% FCS 將 10 mL 全血稀釋至 21 mL。取 6 mL Ficoll（Sigma: Histopaque 1077，產(chǎn)品目錄號(hào)：10771）注入 3 個(gè) 15 mL 錐形瓶中。以較大角度傾斜 10 mL 移液管，并將 7 mL 經(jīng)過(guò)稀釋的血樣加入 Ficoll 中。經(jīng)過(guò)稀釋的血樣將慢慢覆蓋到 Ficoll 上。在剎車(chē)關(guān)閉的情況下，將細(xì)胞放入吊桶式水平轉(zhuǎn)頭離心機(jī)中，以 1500 RPM 的轉(zhuǎn)速，離心 30 分鐘。將上清液抽出，并收集樣品，將之放入 PBS + 5% FCS 中洗滌。重懸細(xì)胞聚合體，并用 ViCell 儀對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后將之稀釋至zui終濃度為每個(gè)試管 1 x 10⁶ 個(gè)細(xì)胞/100 μL，以進(jìn)行染色。

• DuraClone 染色流程

將一百萬(wàn)個(gè) PBMC 加入 DuraClone IM TCR 試管中，隨后渦旋 5 秒鐘。在室溫、避光條件下孵育 20 分鐘后， 用 3 mL PBS 洗滌 PBMC，400 g 離心 5 分鐘。將 PBMC 重懸于 250 μL PBS 中，并從 CytoFLEX 上獲取檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果：

• 用 DuraClone IM TCR 試管快速構(gòu)建 TCR 子集

本文采用 DuraClone IM TCR 試管對(duì)正常 PBMC 進(jìn)行染色，表明通過(guò) CytoFLEX 即可快速對(duì) T 細(xì)胞子集予以測(cè)定。大約 30 分鐘后，PBMC 能夠表征至相應(yīng)的區(qū)域。使用 DuraClone IM TCR 試管是一項(xiàng)切實(shí)可行的方案，能夠取代繁雜的染色流程。

參考文獻(xiàn)：

1. Pregnancy and gamma/delta T cells: taking on the hard questions.Mincheva-Nilsson L. Reprod Biol Endocrinol.2003 Dec 2; 1:120.Review.

2. Characteristics of Vδ1 (+) and Vδ2 (+) γδ T cell subsets in acute liver allograft rejection. Yu X, Liu Z, Wang Y, Wang H, Zhang M,Sun Y, Su H, Jin L, Wang F, Shi M. Transpl Immunol.2013 Dec; 29(1- 4):118-22.

注：

本應(yīng)用說(shuō)明所提供的結(jié)果展示了貝克曼庫(kù)爾特 CytoFLEX 流式細(xì)胞儀上產(chǎn)生的結(jié)果。由于分析儀性能之間存在差異，因此，作者無(wú)法確保使用其他流式細(xì)胞儀也能夠獲取相似結(jié)果。

圖 1 采用 DuraClone IM TCR 試管快速構(gòu)建 T 細(xì)胞受體子集

通過(guò) CD45 染色在淋巴細(xì)胞中圈選 PBMC (A)。隨后基于 TCR γδ 或 TCR αβ (C) 的表達(dá)圈選 Cd3+ 淋巴細(xì)胞 (B)。γδ T 細(xì)胞可對(duì) Vδ1 和 Vδ2 表達(dá)進(jìn)行表征 (D)。αβ T 細(xì)胞可對(duì) CD8 和 CD4 表達(dá)進(jìn)行表征 (E)。